BiFC技術(shù)服務(wù)
BiFC技術(shù)服務(wù)
蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI)是細(xì)胞內(nèi)許多生物過(guò)程的基礎(chǔ)，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝調(diào)控、免疫應(yīng)答和基因轉(zhuǎn)錄翻譯等。研究蛋白質(zhì)間的相互作用對(duì)于闡明蛋白質(zhì)的生物功能以及分子作用機(jī)理具有重要的意義。
蛋白質(zhì)間相互作用研究的方法眾多，雙分子熒光互補(bǔ)(Bimolecular Fluorescent Complimentary, BiFC) 是一種直觀、快速判斷目標(biāo)蛋白在活細(xì)胞中的相互作用和定位的技術(shù)，因其直觀性使得 BiFC 技術(shù)迅速獲得應(yīng)用，已經(jīng)成為檢測(cè)活體細(xì)胞中蛋白質(zhì)相互作用的一種常規(guī)方法。
BiFC技術(shù)基于蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)的原理，將熒光蛋白多肽鏈在某些不保守的氨基酸處切開，形成兩個(gè)互補(bǔ)但各自不發(fā)熒光的 N-末端和 C-末端片段。將它們分別連接到待驗(yàn)證互作的兩個(gè)蛋白質(zhì)A和B上，在細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)這兩個(gè)融合蛋白時(shí)，由于蛋白質(zhì)A與蛋白質(zhì)B發(fā)生相互作用，熒光蛋白的兩個(gè)片段在空間上互相靠近互補(bǔ)，重新構(gòu)建成完整的具有活性的熒光蛋白分子，從而產(chǎn)生熒光，通過(guò)熒光顯微鏡可直觀地觀察到蛋白質(zhì)間的相互作用。
我們的技術(shù)優(yōu)勢(shì)
? 活細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)：細(xì)胞生理狀態(tài)下直接觀察蛋白質(zhì)相互作用，保留了時(shí)空動(dòng)態(tài)信息。實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加直觀和易于理解。
? 高特異性：只有當(dāng)目標(biāo)蛋白相互作用時(shí)，熒光信號(hào)才會(huì)出現(xiàn)，減少了假陽(yáng)性結(jié)果，提高了檢測(cè)的特異性。
? 高靈敏度：檢測(cè)弱或瞬時(shí)相互作用，對(duì)低親和力、短暫相互作用敏感，能夠揭示一些傳統(tǒng)方法難以檢測(cè)到的相互作用。
? 實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)豐富：浦芥專注于植物細(xì)胞樣本分析
實(shí)驗(yàn)流程
服務(wù)內(nèi)容
服務(wù)說(shuō)明
1. 浦芥的BiFC實(shí)驗(yàn)只在煙草中進(jìn)行驗(yàn)證，默認(rèn)設(shè)置1個(gè)實(shí)驗(yàn)組和2個(gè)陰性對(duì)照組。判定實(shí)驗(yàn)成功的標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)組有熒光，而陰性對(duì)照無(wú)熒光。若實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)到熒光，說(shuō)明兩個(gè)蛋白能夠互作，反之說(shuō)明不互作。
2. 為保證煙草轉(zhuǎn)化效率，本公司不接受客戶提供的農(nóng)桿菌。
3. 浦芥提供多組BiFC載體，方便選擇使用。載體選擇參見表 《浦芥生物BiFC可用載體列表》。
浦芥生物BiFC可用載體列表
4. 客戶如有特殊檢測(cè)要求，雙方協(xié)商具體服務(wù)事項(xiàng)。BiFC技術(shù)服務(wù)內(nèi)容包括：基因克隆、載體構(gòu)建與驗(yàn)證、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化、煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化、共聚焦顯微鏡觀察拍照。各項(xiàng)目可整體檢測(cè)也可單獨(dú)檢測(cè)。
5. 收費(fèi)方式：后付費(fèi)，零預(yù)收費(fèi)啟動(dòng)項(xiàng)目。BiFC實(shí)驗(yàn)不成功僅收取載體構(gòu)建費(fèi)用。待項(xiàng)目完成數(shù)據(jù)交與客戶認(rèn)可后，30日內(nèi)開具發(fā)票，轉(zhuǎn)賬付費(fèi)。
6. 結(jié)果確認(rèn)。客戶收到本公司的結(jié)題報(bào)告后，請(qǐng)務(wù)必在7日內(nèi)確認(rèn)結(jié)果，如有問(wèn)題及時(shí)反饋售后人員，到期如無(wú)異議，默認(rèn)該項(xiàng)目成功。
7. 本合作僅限于為科研單位或個(gè)人提供BiFC技術(shù)服務(wù)，所交付的產(chǎn)物僅作為實(shí)驗(yàn)室的研究材料使用，不具備商業(yè)用途，合作雙方應(yīng)在國(guó)家相關(guān)法律法規(guī)允許的范圍內(nèi)使用，違者對(duì)產(chǎn)生的后果自行負(fù)責(zé)，本公司不承擔(dān)任何連帶責(zé)任。
客戶提供材料
1. 待驗(yàn)證互作蛋白的基因序列，名稱等注釋信息，如果特別要求請(qǐng)?jiān)趥渥⒅凶⒚鳎?/span>
2. 如客戶提供載體，需提供載體MCS測(cè)序報(bào)告，如無(wú)測(cè)序報(bào)告則需另外收取測(cè)序費(fèi)用，由本公司代為測(cè)序。質(zhì)粒濃度為>100ng/μl，低溫運(yùn)輸，需提供熒光蛋白的顏色或者激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)等信息；
3. 盡可能詳細(xì)的填寫“BiFC技術(shù)服務(wù)登記表”，發(fā)送至售前銷售的微信 15301627726 或郵箱 sales01@pujiebio.com；
反饋客戶結(jié)果
1. 客戶委托本公司構(gòu)建載體，項(xiàng)目結(jié)束后提供構(gòu)建好的載體及相關(guān)測(cè)序結(jié)果；
2. 激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。默認(rèn)1個(gè)實(shí)驗(yàn)組拍3個(gè)視野，2個(gè)陰性對(duì)照組各拍1個(gè)視野，每個(gè)視野包含熒光蛋白、DIC、Merge共3張圖。
3. 提供包含詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟、分析整理圖片結(jié)果的結(jié)題報(bào)告，以及BiFC激光共聚焦原始圖片。《BiFC技術(shù)服務(wù)結(jié)題報(bào)告-模板》【注：此模板僅供參考】
案例展示
常見問(wèn)題及解析（Q&A）
Q：如何確保BiFC實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到的熒光信號(hào)反映的是真實(shí)的蛋白質(zhì)相互作用？
A: 為了確保熒光信號(hào)的真實(shí)性，需要排除假陽(yáng)性的可能性。假陽(yáng)性可能是由于熒光蛋白片段的非特異性相互作用或其他非目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的相互作用引起的。因此，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)設(shè)置對(duì)照組，如單獨(dú)表達(dá)熒光蛋白片段或目標(biāo)蛋白的對(duì)照組，以排除非特異性相互作用的干擾。也可重復(fù)實(shí)驗(yàn)，保持每次實(shí)驗(yàn)條件（如細(xì)胞類型、培養(yǎng)條件、成像參數(shù)等）的一致性，比較蛋白質(zhì)相互作用結(jié)果是否一致；此外，還可以結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)方法，如免疫共沉淀（Co-IP）、酵母雙雜交（Y2H）、GST pull-down和熒光素酶蛋白互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)（LCA）等，以多角度、多層次地驗(yàn)證蛋白質(zhì)相互作用的真實(shí)存在。
Q：BiFC結(jié)果無(wú)信號(hào)或信號(hào)弱可能的原因是什么？怎么解決？
A: 可能的原因有多種。首先，確認(rèn)載體是否有問(wèn)題，熒光蛋白選擇是否合適，融合蛋白設(shè)計(jì)有無(wú)缺陷，甚至可以對(duì)調(diào)N端和C端的目的基因。其次，有些基因表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)，在原生質(zhì)體中表達(dá)不明顯，可以嘗試在煙草體系中表達(dá)，且適當(dāng)調(diào)節(jié)觀察時(shí)間，以便觀察到更明顯的結(jié)果。同時(shí)，確定激光共聚焦顯微鏡觀察是否有失誤。此外，煙草狀態(tài)不佳也可導(dǎo)致農(nóng)桿菌侵染效率低，蛋白表達(dá)弱，進(jìn)而影響熒光信號(hào)。浦芥生物常年供應(yīng)煙草活體苗，可聯(lián)系相關(guān)負(fù)責(zé)人15301627726索取。
針對(duì)無(wú)信號(hào)的情況解決方法有：① 建議優(yōu)化、升級(jí)載體系統(tǒng)，并檢查融合蛋白的表達(dá)情況；② 優(yōu)化、調(diào)整實(shí)驗(yàn)體系，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，增加菌液濃度，提高乙酰丁香酮用量。③ 在制片過(guò)程中，應(yīng)徹底清理干凈葉片表面雜質(zhì)，排除氣泡，以減少背景干擾。④ 適當(dāng)調(diào)節(jié)觀察時(shí)間，分時(shí)段檢測(cè)（24h/48h/72h），弱表達(dá)蛋白需延長(zhǎng)至96小時(shí)。?如果以上原因都已驗(yàn)證排除，還是沒(méi)有熒光信號(hào)，可能是所研究的蛋白質(zhì)之間確實(shí)不存在相互作用，因此無(wú)法形成完整的熒光蛋白。
Q：為什么有些基因預(yù)測(cè)互作且在酵母雙雜中顯示互作，但BiFC結(jié)果顯示無(wú)信號(hào)？
A: 由于在酵母雙雜實(shí)驗(yàn)中BD融合誘餌蛋白有單獨(dú)激活作用，且AD融合靶蛋白如果有DNA的特異性結(jié)合，也可以單獨(dú)激活報(bào)告基因的表達(dá)，導(dǎo)致最后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性。有些重組還可能會(huì)破壞蛋白之間的互作，且不同外源基因的瞬時(shí)表達(dá)效率大不相同，建議在BiFC之前先做個(gè)亞細(xì)胞定位評(píng)價(jià)一下兩個(gè)基因的表達(dá)效率，以便調(diào)整兩個(gè)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化條件。
Q：在煙草BiFC中什么樣的光才算有效光？
A: 在制片過(guò)程中時(shí)，盡可能清理干凈葉片表面的雜質(zhì)，排除氣泡。看顯微鏡時(shí)，激發(fā)光電壓不能打得太高，初始功率設(shè)置為設(shè)備最大功率的 ?1-5%?（如50mW激光器使用0.5-2.5mW），逐步增加至最低有效信號(hào)強(qiáng)度?，煙草細(xì)胞的輪廓清晰可見，且分布均勻。
有效信號(hào)?必須嚴(yán)格匹配BiFC復(fù)合物重構(gòu)熒光蛋白的特征波長(zhǎng)（如Venus-YFP的激發(fā)488nm/發(fā)射500-550nm）?。信噪比（SNR）≥3（ImageJ定量分析）。與陰性對(duì)照（單獨(dú)VN/VC片段）強(qiáng)度差異＞5倍?。有效信號(hào)必須呈現(xiàn)符合生物學(xué)邏輯的空間分布特征，比如膜蛋白應(yīng)在細(xì)胞邊緣形成連續(xù)輪廓，核蛋白則與DAPI共定位。真正的互作信號(hào)會(huì)在多次實(shí)驗(yàn)中穩(wěn)定出現(xiàn)，且強(qiáng)度隨時(shí)間增強(qiáng)（熒光蛋白正確折疊需要時(shí)間），培養(yǎng)24-48小時(shí)觀察，與熒光蛋白成熟周期相符，若信號(hào)在12小時(shí)就強(qiáng)烈出現(xiàn)，反而可能是假陽(yáng)性。無(wú)效信號(hào)特征?：熒光強(qiáng)度隨時(shí)間驟降（10分鐘內(nèi)＞50%），細(xì)胞形態(tài)變形（如液泡破裂）。Q：一個(gè)蛋白的普通定位和兩個(gè)蛋白的BiFC定位結(jié)果不一致，一個(gè)在細(xì)胞質(zhì)，另一個(gè)在細(xì)胞核？
A:
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